REVIEW JURNAL - EVALUASI TOKSISITAS, AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN ANTIOKSIDAN KOMPONEN BIOAKTIF ROSELA DENGAN VARIASI JENIS PELARUT

Judul	EVALUASI TOKSISITAS, AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN ANTIOKSIDAN KOMPONEN BIOAKTIF ROSELA DENGAN VARIASI JENIS PELARUT
Jurnal	Teknik Industri
Website	http://journal.ipb.ac.id/index.php/jurnaltin/article/view/10863/8385
Volume&Halaman	J Tek Ind Pert. 25 (2): 182-189
Tahun	2015
Penulis	Ike Sitoresmi M Purbowati1)*, Khaswar Syamsu2), Endang Warsiki2), Herastuti  Sri Rukmini1
Reviewer	Rizki Mardiwan
Tanggal  Reviewer	4 November 2017

A. Latar Belakang
     Rosela biasa dikenal dengan tanaman penghasil serat. Namun seiring dengan makin maraknya slogan back to nature dikalangan masyarakat, nama rosela pun ikut terangkat. Tanaman ini digunakan dalam pengobatan tradisional untuk mengatasi tekanan darah tinggi, penyakit lever dan demam (Mazza dan Miniati, 1993; Wang et al., 2000; Tsai et al., 2002). Hal ini disebabkan rosela memiliki kandungan senyawa bioaktif. Azza et al. (2007) menyatakan bahwa kandungan fisikokimia kelopak bunga rosela, yaitu kadar air 12,81%, protein 7,51%, lemak 0,46%, serat 11,17% dan abu 11,24%. Rosela juga mengandung mineral K, P, Na, Ca, Mg, Fe, Zn, Cu dan Mn. Asam askorbat (140,13 mg/100g), total antosianin (622,91mg/100g) and total fenolik (37,42 mg/g bk). Mourtzinos et al. (2008) menyatakan bahwa rosela banyak mengandung senyawa fenolik dan antosianin.
Pemakaian bahan alam sebagai obat tradisional di kalangan masyarakat dijamin keamanannya oleh pemerintah dengan mengimplementasikannya dalam Permenkes No.760/Menkes/Per/IX/1992 tentang obat tradisional dan fitofarmaka. Tahapan-tahapan yang harus dilewati oleh setiap bahan alam sebelum menjadi sediaan fitofarmaka adalah uji farmakologi eksperimental, uji toksisitas, uji klinis, uji kualitas dan pengujian lain sesuai persyaratan yang berlaku demi menjamin keamanan masyarakat dalam mengkonsumsinya.
Fleksibilitas pemanfaatan rosela saat ini masih terbatas mengingat kandungan senyawa bioaktif pada tanaman biasanya sangat kecil. Untuk itu perlu dilakukannya ekstraksi kelopak bunga rosela agar mempermudah pemanfaatannya. Proses pemisahan komponen bioaktif dari rosela haruslah memperhatikan dua hal yang penting, yaitu karakteristik komponen bioaktif rosela dan metode ekstraksi yang dilakukan.

B. Metode Penelitian
1. Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kelopak bunga rosella merah (Hibiscus sabdariffa) yang dibeli di pasar tradisional BeringharjoYogyakarta, pelarut etanol absolute (PA), etil asetat (PA), heksan (PA) dan bahan kimia lain untuk analisa. Bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus ATCC 25923, dan Escherichia coli ATCC 25922. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah larva udang (Artemia salinaLeach), air laut untuk uji toksisitas, media padat Nutrient Agar (NA), media cair Nutrient Broth (NB) untuk perbanyakan dan pemeliharaan kultur bakteri, Kloramfenikol sebagai kontrol positif uji aktivitas antibakteri.
2. Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi blender, saringan, shaker, vakum evaporator, autoklaf, pendingin, inkubator, pipet mikro, multiwell plates, spektrofotometer. Selain itu juga digunakan peralatan gelas untuk analisis kimia.
3. Tahapan Penelitian
Ekstraksi kelopak bunga rosella
Serbuk kelopak bunga rosella kering dengan ukuran 60 mesh sebanyak 10 g direndam dalam pelarut etanol 70%, etil asetat,dan heksan, dengan perbandingan 1:10 (b/v) dimaserasi selama 24 jam pada suhu kamar sambil digoyang menggunakan shaker. Campuran tersebut kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan vacuum evaporator. Ekstrak yang diperoleh digunakan sebagai sampel untuk analisis fitokimia dan pengujian aktivitas lainnya. Penentuan Vitamin C (AOAC, 2000), total kandungan antosianin (Fuleki et al., 1968). Total fenolik ditentukan menggunakan metode Folin-Ciocalteu Chew et al. (2009).
a. Penentuan kandungan fitokimia ekstrak (Harborne, 1996)
Penentuan kandungan fitokimia secara kualitatif dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya golongan senyawa aktif yang terdapat pada ekstrak kelopak bunga rosella, meliputi fenolik, alkaloid, flavonoid, steroid,dan tanin.
b. Analisa senyawa fenolik
Sebanyak 1 mL sampel diteteskan pada spot plate dan ditambahkan NaOH 10 %. Terbentuk warna merah yang menandakan uji positif adanya senyawa fenolik hidrokuinon
c. Senyawa Steroid dan Triterpenoid
Sebanyak 1 mg sampel yang telah kering dilarutkan ke dalam 2 mL kloroform. Kemudian larutan ditambahkan 10 tetes asetat anhidrida dan 3 tetes asam sulfat pekat. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna hijau (senyawa steroid) dan warna merah atau ungu (triterpenoid)
d. Senyawa Alkaloid
Sebanyak 1 mL sampel dikocok dengan 10 tetes H2SO4 2M dan lapisan asamnya dipisahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi Mayer, Wagner dan Dragendorf yang akan menimbulkan endapan warna berturut turut putih, cokleat dan merah jingga.
e. Senyawa Tannin
Sebanyak 1 gram sampel dimasukan ke dalam gelas piala lalu ditambahkan 12 mL air panas dan dididihkan selama 15 menit lalu disaring. Filtrat ditambahkan beberapa mL larutan FeCl3 1%. Timbulnya warna biru tua atau hijau kehitaman menunjukkan senyawa tannin positif
f. Senyawa Flavonoid
Sebanyak 1 mL atau 1 g sampel dimasukan ke dalam gelas piala kemudian ditambahkan 100 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit setelah itu disaring dan filtratnya (10 mL) ditambahkan 0,5 g serbuk magnesium 2 mL alkohol klorhidrat (campuran HCl 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 20 mL amil alkohol. Selanjutnya dikocok dengan kuat. Terbentuknya warna merah, kuning dan jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.
g. Uji toksisitas metode Bhrine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Uji toksisitas dilakukan menggunakan metode (Juniarti et al.,2009) Penetasan telur udang dilakukan dalam sebuah bejana. Satu ruang dalam bejana tersebut diletakan lampu untuk menghangatkan suhu selama penetesan. Air laut dimasukan dalam bejana + 50-100 mg telur udang untuk ditetaskan. Bejana untuk menetaskan telur udang ditutup menggunakan aluminium foil dan dipanaskan dengan lampu selama penetasan.
Sebanyak 10 ekor larva Artemia Salina Leach yang sehat dan berumur 48 jam dimasukan ke dalam vial uji yang berisi air laut. Masing-masing vial uji ditambahkan ekstrak sehingga akan didapat larutan dengan konsentrasi 10, 100, 500, dan 1000 µg/ml. Untuk setiap konsentrasi dilakukan 6 replikasi. Bila sampel tidak larut ditambahkan 2 tetes DMSO.
Uji aktivitas antibakteri dan antioksidan
Penentuan nilai KHM dan KBM (Sharma et al. 2011; Doughari 2006), sedangkan uji aktivitas antioksidan menggunakan metode ferric-tyosianate (Al-Hashimi, 2012)

C. Hasil dan Pembahasan
     Ekstraksi dalam penelitian ini menggunakan tiga jenis pelarut dengan polaritas yang berbeda, yaitu pelarut polar etanol 70%, semi polar etil asetat, dan pelarut non polar heksan. Perbedaan polaritas pelarut dimaksudkan untuk dapat mengetahui semua jenis senyawa metabolit sekunder yang ada dalam kelopak rosella
Fitokimia ekstrak kelopak bunga rosella pada berbagai pelarut
Hasil ekstraksi ini memberikan jumlah dan jenis senyawa dalam ekstrak kasar yang berbeda-beda. Perbedaan ini menunjukkan bahwa berbagai jenis pelarut yang digunakan berhasil mengekstrak golongan senyawa metabolit yang memang berbeda.
Secara umum kelopak bunga rosella mengandung senyawa fenolik, tanin, flavonoid, steroid,dan alkaloid. Etanol 70% mampu mengekstrak senyawa fenolik, tanin, flavonoid dan alkaloid. Etil asetat dapat mengekstrak senyawa fenolik, flavonoid dan alkaloid. Ekstrak heksan hanya mengandung fenolik dan steroid. Penelitian sebelumnya (Olaleye, 2007) menunjukkan alkaloid, saponin, flavonoid dan steroid adalah senyawa bioaktif utama yang terdapat dalam kelopak bunga rosella.
Menilik hasil yang diperoleh, pelarut heksan memiliki kemampuan ekstraktif yang paling rendah terhadap total fenolik, yaitu 2,73 + 0,31 mg/g, pelarut etil asetat menghasilkan total fenolik sebesar 7,51 + 0,49 mg/g sedangkan pelarut etanol 70% memiliki kemampuan ekstraktif fenolik yang paling tinggi, yaitu 19,45 + 0,32 mg/g. Ini menunjukkan bahwa dalam kelopak rosella senyawa fenolik dari golongan polar lebih banyak dibandingkan dari golongan semipolar dan nonpolar.
Dalam ekstraksi, polaritas pelarut memainkan peranan penting. Polaritas pelarut ditentukan konstanta dielektrik. Markom (2007) menyatakan bahwa konstanta dielektrik air, etanol, etil asetat dan heksan berturut turut sebagai berikut: 80,20: 24,30; 6,02;1,89. Etanol 70% dapat mengekstrak total fenolik sebanyak 19,45 mg/g. Jika dibandingkan dengan etil asetat dan heksan yang mampu mengekstrak sebanyak 7,51 mg/g dan 2,73 mg/g berarti polaritas etanol 70% lebih sesuai dengan senyawa fenolik hasil metabolisme sekunder kelopak bunga rosella, sehingga etanol 70% lebih efisien dalam mengekstrak senyawa fenolik dibandingkan pelarut heksan dan etil asetat.
Uji toksisitas ekstrak kelopak bunga rosella pada berbagai pelarut
Uji toksisitas dilakukan untuk mengetahui sifat toksik bahan alam yang terekstrak keluar jika nantinya digunakan sebagai bahan fitofarmaka. Mengetahui toksisitas suatu bahan akan memberikan informasi dosis aman yang dibutuhkan jika bahan alam ini akan dijadikan obat. LC50 adalah konsentrasi yang dibutuhkan untuk mematikan 50% dari organisme uji. Dosis obat yang nantinya diformulasikan untuk keperluan obat bagi manusia, diformulasikan dengan dosis di bawah konsentrasi LC50 ini. Hasil BSLT ekstrak kasar etanol 70%, etil asetat dan heksan, dari kelopak bunga rosella secara lengkap dapat dilihat pada Tabel 4. Nilai LC50 ekstrak kasar etanol 70% kurang dari 1000 ppm, yaitu sebesar 510,613 ppm, sedangkan ekstrak kasar heksan dan etil asetat lebih tingi dari 1000 ppm, yaitu 1718,446 dan 1241,983 ppm. Hal ini berarti bahwa ekstrak etanol 70%, lebih toksik dibandingkan ekstrak heksan dan etil asetat.
Aktivitas antibakteri dari ekstrak tanaman disimpulkan banyak peneliti karena kandungan senyawa bioaktif di dalamnya (Al Mamun et al., 2011; Bukar et al., 2010). Senyawa fenolik disintesis tanaman sebagai respon infeksi oleh mikroorganisme. Aktivitas antibakteri ini dimungkinkan oleh kemampuan fenoliks membentuk kompleks dengan dinding sel bakteri. Hal ini sesuai dengan (Al-Hashimi, 2012; Garcia Alonso et al., 2006) yang menyatakan bahwa polifenolik dari tanaman mampu berfungsi sebagai zat antibakteri
Perbedaan aktivitas terhadap pertumbuhan bakteri yang dicobakan disebabkan karena perbedaan kandungan fithokimia dalam ekstrak. Ebi dan Ofoefule (1997) menyatakan bahwa ekstrak kasar mungkin mengandung senyawa inaktif lain yang bersifat antagonis satu sama lain, seperti klorofil, lemak dan lilin. Ekstrak heksan tidak memiliki aktivitas antibakteri, karena meski mengandung fenolik, ekstrak diduga mengandung juga senyawa inaktif lain. Aktivitas antibakteri ekstrak yang digunakan dalam in vitro tes ini dapat lebih tinggi jika senyawa aktif dari ekstrak dapat dimurnikan.
Uji aktivitas antioksidan ekstrak kelopak bunga rosella pada berbagai pelarut
Antioksidan sangat signifikan berperan untuk menjaga kesehatan manusia, dan berfungsi sebagai penangkal radikal bebas dengan membentuk komplek dengan pro-oksidan seperti metal, bahan pereduksi dan oksigen bebas.
Aktivitas antioksidan dipengaruhi oleh jumlah antioksidan yang terkandung dalam suatu bahan dan kemampuan senyawa antioksidan itu dalam menangkap radikal bebas. Hasil analisa menunjukkan etanol 70% memiliki aktivitas antioksidan yang lebih baik dibandingkan ekstrak etil asetat dan heksan. Hal ini ditunjukkan dengan nilai IC50 ekstrak etanol 70% yaitu pada dosis ekstrak kasar 439,32 ppm, ekstrak etil asetat 587,92 ppm, ekstrak heksan 481,39 ppm dengan kandungan vitamin C berturut turut 44,75; 34,45; 38,69 ppm. Semakin kecil nilai IC50, menandakan semakin aktif ekstrak. Hasil penelitian juga mengindikasikan bahwa aktivitas antioksidan masing masing ekstrak memiliki korelasi dengan total fenolik, vitamin C dan antosianin, seperti pada penelitian yang dilakukan oleh Yang et al. (2012), Al-Hashimi, (2012). Namun tingkat korelasi masing masing variable berbeda untuk tiap pelarut. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol 70% memiliki korelasi (R2) terhadap total fenolik, vitamin C dan antosianin berturutturut sebagai berikut: 0,981; 0,980; 0,983. Pelarut etil asetat 0,811; 0,686; 0,811 dan pelarut heksan memiliki korelasi (R2) aktivitas antioksidan yang kuat terhadap vitamin C dan total fenolik yaitu 0,991 dan 0,962. Konsep umum yang selama ini diketahui, semakin banyak senyawa fenolik dalam sampel, semakin tinggi aktivitas antioksidan yang diperlihatkan. Menurut Tsai et al. (2002) aktivitas antioksidan ekstrak rosella memiliki korelasi yang kuat dengan kandungan antosianin. Falade et al. (2005) menyatakan bahwa ekstrak rosella memiliki kandungan vitamin C yang tinggi. Vitamin C dikenal sebagai senyawa antioksidan. Hasil ini dimungkinkan karena aktivitas antioksidan tidak hanya disebabkan adanya kandungan fenoliks, namun dapat disebabkan karena adanya beberapa fitotokimia lain seperti asam askorbat, tokoferol dan pigmen dengan mekanisme sinergis diantaranya turut menentukan aktivitas antioksidan.

D. Simpulan dan Saran

Simpulan
Kelopak bunga rosella mengandung komponen bioaktif flavonoid, senyawasenyawa fenolik, tannin, alkaloid, dan steroid. Etanol 70% lebih efektif mengekstrak senyawa-senyawa fenolik yaitu sebesar 19,45 + 0,32 mg/g dibandingkan etil asetat dan heksan yaitu sebanyak 7,51 + 0,49 mg/g dan 2,73+ 0,31 mg/g. Ekstrak etanol memiliki nilai LC50 dibawah 1000 ppm, yaitu 510,613 ppm, dibandingkan etil asetat dan heksan yang berturut turut 1241,983, dan 1718,446 ppm. Ekstrak etanol 70% dan etil asetat memiliki aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan nilai zona bening berturut turut sebesar 7,7 + 2,01b mm dan 7,53 + 2,19b mm untuk aktivitas terhadap terhadap S aureus. Zona bening yang terbentuk melawan pertumbuhan E coli adalah 13,28 + 3,30b mm dan 12,35 + 3,13b mm. Ekstrak heksan tidak memiliki aktivitas antibakteri. Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan nilai IC50 ekstrak etanol 70%, etil asetat dan heksan berturut turut adalah 439,32; 587,916; 481,392 ppm.

Saran
Perlu adanya evaluasi lebih lanjut mengenai kemungkinan hubungan sinergisme antar komponen bioaktif terhadap aktivitas antioksidan dan antibakteri ekstrak.

PPT